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如何保養(yǎng)和使用HPLC柱

2010-12-27

如何保養(yǎng)和使用HPLC柱
在使用過程中色譜柱的柱效不斷下降，N不斷減小，色譜峰越來越不對稱，形成嚴(yán)重拖尾峰，柱壓也在不斷升高。這一切的魁禍?zhǔn)拙褪翘盍衔⒘５男螤畎l(fā)生了改變。
填料自身的溶蝕，改變微粒間的堆砌形狀，形成塌陷；變得不規(guī)則，越來越??；流動相和樣品物質(zhì)逐漸被子微粒吸附，阻塞了微粒間的孔道，變的也越來越小。所以引起壓力明顯升高。
柱填料的改變必然引起柱頭形狀的改變，從而引起色譜峰形的改變。
一根色譜柱可能分析數(shù)千個樣品后性能仍然良好，也可能分析數(shù)個樣品后就不行了，有眾多因素影響色譜柱的壽命。所以要正確使用色譜柱，注意以下5個方面。
第一，加保護柱
保護柱是短柱，不超過3cm，加在分析柱前。要求保護柱的內(nèi)徑與分析柱的內(nèi)徑相同，兩柱填裝的填料也相同。如分析住使用C18鍵合相填料，保護柱也用鍵合相填料，但保護柱填料的粒度比較大。分析柱常用5um的填料，保護柱一般用10—20um的填料以減少壓力的增加。
保護柱中的填料的化學(xué)成分可以預(yù)飽和流動相，減少分析柱中同種填料的溶蝕；保護柱收集流動和樣品中垃圾，減少分析柱的污染與阻塞。
加了保護柱增加系統(tǒng)壓力，增寬了色譜峰的寬度，使用恰當(dāng)可以避免這些不得因素。
分析50～100個樣品可能就要新保護柱了。如果樣呂“臟”可能換得更勤。商品保護柱由柱套和柱芯組成，只要換上新柱芯就行了。換下的舊柱芯要扔掉，防止再用。
第二，避免高壓沖擊
色譜柱經(jīng)得起高壓，但經(jīng)不起突然變化的高壓沖擊。進樣閥的轉(zhuǎn)動緩慢，泵啟動快，多柱間的切換都引起突然的高壓，對色譜柱的柱床和色譜柱的配件會產(chǎn)生損壞。
轉(zhuǎn)動六通進樣閥從“裝樣”到“進樣”的蹭瞬時切斷流動相的流動，在閥的泵側(cè)壓力升高，在閥的柱側(cè)壓力降低轉(zhuǎn)到位后一個壓力沖擊。前面已婚介紹在進樣器的泵到柱之間安裝壓力旁路支管可以緩解壓力沖擊，但支管的流速受到限制，要求轉(zhuǎn)動進樣閥的動作要快。
泵的啟動不應(yīng)太快。如選用3mL/min的流量極要一下子開到3mL/min,先1mL/min，再到2mL/min，然后3mL/min，每個改動的間隔大于30s
第三，選用溫和的色譜條件。
多數(shù)色譜柱有很寬的實驗條件范圍，但在具有使用中諸多條件疊加在一起，如pH、溫度、流動相種類等，使受到限制。
以硅膠為載體的鍵合相填料要求使用的流動相pH值在2.5～7.5之間，低于pH2的流動相可能在載體硅膠和鍵合的硅烷之間發(fā)生水解反應(yīng)，使烷鏈掉下來；高于pH7的流動相可能溶蝕載體硅膠。結(jié)果非堿性組分的保留不斷減少，堿性組分的保留增加，峰變寬。
已有鍵合相填料的新產(chǎn)品可在pH14的流動相中使用。
以硅膠和以硅膠為載體的鍵合相填料、陰離子交換填料的色譜柱超過60℃后，會增加對流動相中化學(xué)物質(zhì)的吸附。高溫下會引起小顆粒填料柱柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。40℃以上使用3um填料，70℃以上使用5um填料柱，會使N降低50%。
HPLC柱的使用柱溫要求恒定，要求加色譜柱恒溫箱，不要讓色譜柱放在裸露的自然環(huán)境中，下面以實驗例說明柱溫對色譜分離的重要性。
①柱溫對色譜峰形的影響均勻恒定的柱溫使色譜峰形對稱，狹窄，杯拖尾。色譜柱溫不均勻使色譜峰形變寬、拖尾。
②柱溫對保留的影響用75℃和54℃兩種柱溫和相同的色譜條件分離同一種樣呂，后一個色譜峰的保留時間分別為10min和13min，54℃柱溫的tR增加了26%，在約1℃增加tR1%～3%。如果柱溫處在室溫下，按上面的推算，晴天（25°）某組分tR為15min，陰天（21°），氣溫下降4℃，取折中（1℃增加tR2%），某組分tR為16min10s，保留時間增加了1min10s.
③柱溫對色譜峰選擇性的影響從75還發(fā)現(xiàn)柱溫54℃時；峰2（硝基乙烷）tR為120s，峰3（m-鄰苯二甲酸）tR為2min45s，峰5（4-氯丁烷）tR為4min25s，峰6（3-氰基苯甲酸）tR為6min50s。柱溫75℃時：峰2tR為1min40s，峰3tR為1min55s，兩峰的Rs變差；6tR為4min20s，峰5tR為4min40s，兩峰的Rs變差，與柱溫54℃相比，峰位也發(fā)生了改變，峰5（4-氯丁烷）跑到峰6（3-氰基苯甲酸）后面了。
④流動相溫度與柱溫不一致對分離的影響現(xiàn)在已普遍使用色譜柱的恒溫裝置，但會忽略保持流動相溫度與譜柱溫度的一致。
第四，凈化樣品
凈化樣品的概念不同于樣品預(yù)處理，意指HPLC樣品通過預(yù)處理等程序后，在進樣前還要凈化樣品。用特指的溶劑或流動相溶解、稀釋色譜樣品，多數(shù)化學(xué)物質(zhì)（包括要分離的組分）都能溶解成澄明的樣品溶液，進入色譜柱后還會流出來，不會對色譜柱造成危害。如果樣品含有固體顆粒沉淀，樣品渾濁不透明，樣品中有絮狀物，這種“臟”樣品中的顆粒會磨損六通進樣閥中的轉(zhuǎn)子，導(dǎo)通轉(zhuǎn)子上的三個導(dǎo)槽。在六通進樣器分曾通過。
“臟”樣品對色譜柱的分離效能和色譜柱壽命影響也很大工業(yè)，有些物質(zhì)不可逆地吸附在填料表面上會增加柱壓，降低柱效，色譜峰形變差、變壞，改變組分的保留參數(shù)。即使在分析柱前加了保護柱，而“臟”樣品會使保護柱很快阻塞，系統(tǒng)壓力很快升高。
用針頭過濾器過濾樣呂可以濾除樣品中90%以上的雜質(zhì)，能有效地保護進樣閥和色譜柱。針頭進樣器如：兩片帶管子的塑料圓盤中間緊壓一層過濾膜，過濾膜孔＜5um。用前選用進樣針筒吸水沖洗針頭過濾器，然后用甲醇，再用流動相沖洗，后用進樣針筒吸取樣品后通過針頭過濾器過濾樣品準(zhǔn)備進樣。
第五，用后沖洗色譜柱和整個HPLC系統(tǒng)。
每次工作結(jié)束后用強溶劑沖洗柱和色譜系統(tǒng)是一個良好的習(xí)慣。用正相色譜法分析樣品后可用配制原流動相的主要試劑（去掉酸、堿、離子化合物等到）加5%甲醇沖洗。例如分析用的原流動相為正已烷三氯甲烷-氯水（體積比為：98：1.6:0.5),沖沖洗中去掉0.5%的氨水，加進5%的甲醇。不含有氨的下已烷-三氯甲烷沖洗液，因“記憶”效應(yīng)很快帶走色譜柱和色譜系統(tǒng)中的氨。強溶劑甲醇能有效地沖去留在柱上的強吸附成分。
同樣，用反相色譜法分析樣呂后用去掉酸、堿、鹽的配制原流動相的主要度劉作為沖洗液。如分析用的原流動相為水-甲醇-磷酸鹽緩沖液（40：60：0.01），就用水-甲醇（40：60）做沖洗液，很快去除系統(tǒng)中的磷酸鹽，后改用水-甲醇（90：10）沖洗。
沖洗過的色譜柱和色譜系統(tǒng)不會因鹽類析出晶體阻塞管道、接頭，污染檢測器池窗，也不會因分析生物樣品后蛋白質(zhì)等沉淀被柱吸附，降低分離效能，也防止色譜系統(tǒng)內(nèi)霉菌和藻類繁殖、生長。